Absolute Quantifizierung von Proteinen in komplexen Proben mittels Massenspektrometrie

Für eine Vielzahl von Proteinen sind der Nachweis und die Quantifizierung mittels immunologischer Verfahren, wie Immunhistochemie, ELISA und Western-Blotting, aufgrund fehlender spezifischer Antikörper nicht möglich. Die Anwendung massenspektrometrisch-basierter bioanalytischer Verfahren bietet die Möglichkeit, diese Problematik zu umgehen.
Die AQUA-Strategie ist die Methode der Wahl für eine absolute Quantifizierung von Proteinen in einer komplexen Mischprobe durch die Verwendung von LC-MS/MS, unterstützt durch Multiple Reaction Monitoring (MRM). Dabei werden synthetische, Isotopen-markierte Peptide, Analoga zu nativen Peptiden des Proteins, als interner Standard in einer definierten Menge zur Probe gemischt. Die Durchführung erfolgt in einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (4000 Q Trap LC/MS/MS system, Applied Biosystems). Das MRM erlaubt die sensitive Detektion von Vorläufer-Fragment-Ionen-Übergängen, welche ein diagnostisches Signal  für das Vorhandensein eines Peptides darstellen. Voraussetzung für die Quantifizierung eines Zielproteins mittels AQUA ist die Ermittlung von geeigneten, Protein-spezifischen Peptiden und ihrer Anwendbarkeit in der MRM-Analyse. Precursor-Fragment-Ionen-Übergänge werden dabei unter dem Aspekt optimaler Selektivität und Empfindlichkeit gewählt. Anschließend werden von den ermittelten Peptiden unter Einbau einer schweren, isotopen-markierten Aminosäure-Standardpeptide (sogenannte heavy peptides) synthetisiert, welche die gleichen biophysikalischen Eigenschaften besitzen, sich aber in ihrer Masse von den natürlich vorkommenden Gegenstücken unterscheiden.

Abb.1: Peptididentifizierung in der MS/MS-Analyse

Für die absolute Quantifizierung wird eine definierte Menge des Standardpeptides der Proteinprobe zugesetzt, proteolytisch gespalten, mittels nanoHPLC separiert und online der MS-Analyse unterzogen. Eine absolute Quantifizierung des Proteins in der Probe erfolgt durch mindestens zwei spezifische Peptide, indem die jeweiligen Signalintensitäten (AUC, area under the curve) der Peptid-Ionen in den MRM-Spektren des nativen Peptides und des Standardpeptides verglichen werden.  

Abb.2: Quantifizierung mittels Multiple Reaction Monitoring (MRM)