Die Glykosylierung von Proteinen ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die Einfluss auf Faltung, Lebensdauer und Funktion von Proteinen nimmt. Zwei Formen der Glykosylierung können unterschieden werden:

a) N-Glykosylierung durch Anheftung eines Zuckers an den Stickstoff der Seitenkette eines Asparaginrests
b) O-Glykosylierung durch Verknüpfung über den Sauerstoff der Seitenkette eines Serin- bzw. Threoninrests.

Für die Untersuchung von Glyko-Proteinen kann eine Vielzahl von Methoden zum Einsatz kommen. Lektine, die unterschiedliche Zuckerspezifitäten haben, können zur Anreicherung bzw. Detektion dieser Proteine verwendet werden. Zur Proteinauftrennung kommen neben Gel-basierten Methoden vor allem die Flüssigkeitschromatographie (LC; liquid chromatography) mittels Anionentauschersäulen oder Säulen mit Umkehrphasen-Materialien (reverse phase, RP) zum Einsatz.
Neben der spezifischen Detektion gelelektrophoretisch aufgetrennter glykosylierter Proteine besteht in unserer Gruppe deren Analyse in der Regel aus zwei Strategien: der Untersuchung der Glykanzusammensetzung und –struktur sowie der Lokalisation der Glykosylierungsstelle innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins. Zur Analyse der Zusammensetzung und Struktur der Glykane werden diese zunächst mit einem geeigneten Enzym wie z.B. PNGaseF (bei N-Glykosylierungen) oder chemisch vom Protein abgetrennt. Für die Charakterisierung der Glykan-Struktur bieten sich anschließend unterschiedlichste Möglichkeiten. Gebräuchliche Methoden sind bei uns die Anionentauschchromatographie (HPAEC-PAD) oder die massenspektrometrische Analyse mittels MALDI-TOF/TOF-MS [1, 2]. Weiterhin verwenden wir die in der Peptidanalytik gebräuchliche Flüssigkeitschromatographie mittels reverse phase (RP) Materialien (nano-RP-LC). Für die Bindung an das hydrophobe Säulenmaterial müssen die hydrophilen Glykane allerdings zuvor z.B. mit 2-Aminobenzamid oder Anthranilsäure modifiziert werden [3, 4]. Eluiert werden sie anschließend durch Erhöhung des Anteils an organischem Lösungsmittel, bei sehr geringen Flussraten von 100-300nl/Min., was eine sehr hohe Sensitivität der Methode bedingt. Durch eine Kopplung an ein ESI-Massenspektrometer ist zudem eine direkte Analyse der Glykane möglich (nano-RP-LC-ESI-MS/MS; s. Abb. 1A).
Zur Bestimmung der genauen Lokalisation der Glykosylierungsstelle innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins werden diese mit geeigneten Proteasen wie Chymotrypsin, Glu-C, Elastase oder Trypsin verdaut und anschließend ebenfalls mittels MALDI-TOF/TOF-MS und insbesondere der nano-RP-LC-ESI-MS/MS untersucht. Letztere Methode bietet bei der Wahl des richtigen Massenspektrometers die Möglichkeit, zwei unterschiedliche Verfahren der Glyko-Peptid-Fragmentierung zu nutzen. Die CID-Methode (collision induced dissociation) führt vor allem am Glykan-Rest zu stärkerer Fragmentierung (s. Abb. 1B). Hierbei entstehen Glykan-spezifische Abspaltungen (Reporter-Ionen), die zum Auffinden glykosylierter Peptide genutzt werden. Komplettiert werden die Ergebnisse durch anschließende ETD-Experimente (electron transfer dissociation), da mit dieser alternativen Fragmentierungsmethode neben Brüchen an labilen Glykanen vor allem Informationen über die Aminosäurezusammensetzung des Peptids generiert werden können [5, 6].

A

B