Hier finden Sie eine Übersicht der von uns außerhalb unserer Arbeitsgruppen durchgeführten Projekte:

Therapeutische Mechanismen umbilikaler Zellen in der Behandlung perinataler hypoxisch-ischämischer Hirnschäden

Vor und während der Geburt kann es durch Sauerstoffmangel zu Verletzungen des zentralen Nervensystems kommen, die zu lebenslangen motorischen und kognitiven Beeinträchtigungen führen können. Zellen aus Nabelschnurblut bieten die Möglichkeit einer Zell-Therapie bei diesen frühkindlichen Hirnschäden.

Im Tiermodell des perinatalen hypoxisch-ischämischen Hirnschadens (Levine Modell) konnte gezeigt werden, dass die transplantierten umbilikalen Zellen gezielt zum Ort der Läsion wandern (1) und zu einer signifikanten Verbesserung Läsions-induzierter motorischer Defizite beitragen (2). Zudem scheinen die Zellen aus Nabelschnurblut auf systemischer Ebene Inflammation und Apoptose zu senken, eine Neuroprotektion herbeizuführen (3), sowie die Ausbildung reaktiver Astroglia zu reduzieren. Positive Auswirkungen auf die neuronale Zellpopulation konnten zudem in Untersuchungen zur kortikalen Plastizität im Nervensystem gezeigt werden.

Obwohl nach Transplantation umbilikaler Zellen Effekte auf Inflammation, astrogliale Aktivierung und neuronalen Zelltod beobachtet wurden, sind die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen weitgehend ungeklärt. Umbilikale Zellen sekretieren eine Vielzahl von Proteinen, die möglicherweise positiv auf endogene Zellen des läsionierten Gehirns wirken (4).

Ziel des Projektes ist das Verständnis der dem ‚therapeutischen' Effekt umbilikaler Zellen zugrunde liegenden Mechanismen, um die klinische Applikation des Nabelschnurblutes bei Erkrankungen des Nervensystems zu bahnen.

Dazu soll die Identifizierung der beteiligten zellulären Komponen­ten in verschiedenen Zellpopulationen des Gehirns beitragen. Mittels differen­zieller Pro­teom­­ana­lyse (2D-DIGE / Massens­pektrometrie) soll der Einfluss umbilikaler Zellen auf hyp­oxisch-ischämische Astro­zyten und Neurone untersucht werden.

Über die Identifizierung und Cha­rak­terisierung dif­ferenziell regulier­ter Pro­teine in neuralen Zellen des Gehirns können die ‚thera­peu­­tischen' Effekte der umbilika­len Zellen gezielt unter­sucht und Rückschlüsse über die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen erlangt werden. Die Determinierung von Proteinen, die durch Hypoxie und/oder umbilikale Zellen beeinflusst werden, ermöglicht die Entwicklung und Optimierung einer bisher fehlenden klinischen Therapie.

Referenzen:

(1) Rosenkranz et al., J Neurosci Res (2010) 88(6):1223-1233.

(2) Meier et al., Pediatr Res (2006) 59(2):244-249.

(3) Pimentel-Coelho et al., Stem Cells Dev (2010) 19(3):351-358.

(4) Neuhoff et al., Exp Hematol (2007) 35(7):1119-1131.

Kooperationen:

Prof. Dr. Carola Meier, Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes

Dr. Katrin Marschner, St. Elisabeth Hospital Bochum

Etablierung einer sensitiven Methodik zur selektiven Anreicherung und absoluten Quantifizierung von Peptiden (TXP-AQUA)

Für die absolute Quantifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie (MS) hat sich die Verwendung Isotopen-markierter Peptide als interner Kalibrationsstandard (AQUA) als eine geeignete Methode herausgestellt. Diese Messmethode erlaubt durch die Beobachtung proteotypischer Peptide mehrerer Proteine deren simultane Quantifizierung in einem einzigen Probenlauf und reduziert damit Zeitaufwand und Bedarf an Probenmaterial. Ebenso kann zwischen hoch homologen Proteinen differenziert werden, was bei immunologischen Methoden, wie ELISA und Western-Blot, aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper nicht möglich ist. Da die Methode generell durch die Abundanz der Zielproteine in einer komplexen Probe limitiert ist, sind effiziente Fraktionierungsverfahren für die zu quantifizierenden Peptide notwendig. Das erst kürzlich neu entwickelte TXP (Triple X Proteomics) Konzept zur immunologischen Anreicherung proteotypischer Peptide, verwendet Antikörper, welche kurze, terminale Aminosäuresequenzen der Peptide erkennen. Diese können für die Anreicherung bestimmter Klassen von Signaturpeptiden, die das gleiche terminale Epitop aufweisen, verwendet werden und somit die Anzahl erforderlicher Antikörper reduzieren. Ziel des beantragten Projektes ist die Etablierung einer reproduzierbaren und hochsensitiven proteinanalytischen Quantifizierungsmethode, welche die TXP-Technologie und AQUA verbindet (TXP-AQUA). Dafür soll zunächst aufgrund bisheriger Untersuchungen und Ergebnisse der Antragsteller das Arzneistoff-metabolisierende System der humanen Leber untersucht werden. Repräsentative Vertreter dieses Systems mit zentraler Bedeutung im Hinblick auf die Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen sind die hoch homologe Cytochrom P450 (CYP) -Subfamilie CYP3A, bestehend aus CYP3A4, 3A5 und 3A7, der Aufnahmetransporter OATP1B1, der ABC-Effluxtransporter MDR1 (multidrug resistance 1) sowie der nukleären Rezeptor Pregnan-X-Rezeptor (PXR). Die Erhebung quantitativer Daten dieser Proteine können einen Beitrag zum allgemeinen Verständnis des Arzneistoffabbaus leisten. Allgemein eröffnet eine erfolgreiche Integration der TXP-Affinitätschromatographie in einen bioanalytischen workflow neue Möglichkeiten für die qualitative und quantitative Erfassung niedrig-abundanter Proteine und ermöglicht somit den Zugang zur Identifizierung von neuen potentiellen Biomarker. Bei erfolgreicher Etablierung der TXP-AQUA Methode ist diese in Abhängigkeit der generierten Antikörper generell auf jedes denkbare Protein bzw. Proteingruppe oder ganzes Proteom anwendbar.

Ziel des Programms:

Ziel des geplanten Projektes ist, wie unter 2. beschrieben, die Etablierung einer proteinanalytischen Methode zur absoluten Quantifizierung relevanter Proteine des Arzneistoffabbaus mittels Massenspektrometrie. Die Methode kombiniert eine Immunaffinitätsfraktionierung Protein-spezifischer Peptide mittels der neuartigen TXP-Antikörper mit AQUA zur absoluten Quantifizierung der Proteine (TXP-AQUA) (Abb.4). Die TXP-Affinitätschromatographie soll dazu dienen, unique proteotypische Peptide auch niedrigst abundanter Proteine aus komplexen Proben anzureichern, um die analytische Sensitivität der AQUA-Technologie zu verbessern.

Für eine erfolgreiche Etablierung der Methodik ist die Evaluierung der folgenden Punkte unumgänglich, deren Umsetzung in 3.2 noch einmal in einem detaillierten Arbeitsprogramm erläutert wird:

(1) Bindungseffizienz synthetischer Peptide an TXP-Antikörper

(2) Epitopspezifität (Kreuzreaktivität) der TXP-Antikörper

(3) Anreicherungseffizienz der TXP-Antikörper

(4) Detektionslimit (LOD), Quantifizierungslimit/Sensitivität (LOQ) und Linearität der Methode

(5) Richtigkeit und Reproduzierbarkeit der Methode.

Arbeitsprogramm:

Die in enger Kooperation mit den Experten des NMI generierten TXP-Antikörper zur Anreicherung der Signaturpeptide der Cytochrome P450 Enzyme CYP3A4, 3A5, 3A7, dem Efflux-Transporter MDR1 sowie PXR sollen in einer Studie auf Bindungseffizienz und Epitopspezifität (Kreuzreaktivität) unter Verwendung synthetischer Peptide sowie realer biologischer Proben (humane Lebermikrosomenfraktion, Gesamtzelllysat primärer Hepatozyten) getestet werden. Des Weiteren soll OATP1B1, ein an der basolateralen Membran-ständiger Arzneistoffaufnahme in Hepatozyten, in die Studie (Definition proteotypischer Signaturpeptide, TXP-Antikörpergeneration) mit eingeschlossen werden. Das Arbeitsprogramm umfasst konkret die Evaluierung folgender Punkte:

(1) Bindungseffizienz synthetischer Peptide an TXP-Antikörper:

- Anreicherung leichter, synthetischer Signaturpeptide (Konzentrationsreihen) aus reiner Peptidmischung bzw. Analyt-freien biologischen Probe („Einspiken" der Peptide in Hefelysat und anschließender tryptischer Verdau) mittels TXP-Affinitätschromatographie

- Hinzusetzen isotopen-markierter (schwerer), synthetischer Peptide nach Anreicherungsschritt äquivalent zur Ausgangsmenge der leichten synthetischen Peptide (isotopen-markierten Peptide der CYP3A Subfamilie bzw. die leichten Peptide sind bereits vorhanden)

- Auftrennung der Peptide mittels nano-HPLC (75 mm id x 250 mm PepMap^TM reversed phase Säule, LC Packings Dionex) und online ESI-MS-Analyse im multiple reaction monitoring Modus (4000QTRAP, Applied Biosystems)

- Vergleich Signalintensitäten von schweren zu leichten Peptiden zur Ermittlung der Bindungseffizienz (Verlustkalkulation, Optimierung: Antikörpermenge, Inkubationsbedingungen für Antikörper-Peptid-Bindung)

(2) Epitopspezifität (Kreuzreaktivität):

- TXP-Affinitätschromatographie endogener Peptide eines tryptischen in-Lösungsverdaus humaner Primärhepatozyten

- Auftrennung der Peptide mittels nano-HPLC (75 mm id x 250 mm PepMap^TM reversed phase Säule) und online ESI-MS/MS-Analyse (HCT Ultra PTM Discovery System, Bruker Daltonics; LTQ Orbitrap, Thermo Scientific) für eine globale Identifizierung aller Peptide in der Anreicherungsfraktion

- Bestimmung der Peptide mit spezifischen bzw. unspezifischen C-terminalen Epitopen

- Abschätzung der Kreuzreaktivität inkl. Test auf Stringenz der Waschbedingungen zur Reduktion unspezifischer Bindungen

(3) Anreicherungseffizienz:

- Hinzusetzen isotopen-markierter (schwerer), synthetischer Peptide (Konzentrationsreihe) zu tryptischen in-Lösungsverdau humaner Primärhepatozyten

- (a) Vorfraktionierung mittels TXP-Affinitätschromatographie

(b) ohne Vorfraktionierung

- Auftrennung der Peptide nano-HPLC-Säule (75 mm id x 250 mm PepMap^TM reversed phase Säule) und online ESI-MS-Analyse im multiple reaction monitoring Modus (4000QTRAP, Applied Biosystems)

- Ermittlung der Anreicherungseffizienz über (a) und (b); Vergleich des Signal-Rausch-Verhältnisses (S/N) und Limit of Detection (LOD)

Neben der Funktionalität der Antikörper soll eine umfangreiche Studie zur Validierung des quantitativen TXP-AQUA Ansatzes unter den Aspekten der Sensitivität (Limit of Detection (LOD), Limit of Quantification (LOQ)), Linearität, Richtigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden.

(4) LOD, LOQ und Linearität:

- Hinzusetzen leichter, synthetischer Signaturpeptide (Konzentrationsreihen) und schweren isotopen-markierter Peptide als interner Standard in fixer Konzentration zu einer Analyt-freien biologischen Probe („Einspiken" der Peptide in Hefelysat und anschließender tryptischer Verdau)

- Anreicherung der Signaturpeptide mittels TXP-Affinitätschromatographie

- Auftrennung der Peptide nano-HPLC-Säule (75 mm id x 250 mm PepMap^TM reversed phase Säule) und online ESI-MS-Analyse im multiple reaction monitoring Modus (4000QTRAP, Applied Biosystems)

- Bestimmung des Limit of Detection (LOD) anhand der Konzentrationsreihe der leichten synthetischen Peptide

- Bestimmung des Limit of Quantification (LOQ)

- Test auf Linearität der TXP-AQUA Methode

(5) Richtigkeit und Reproduzierbarkeit

- Vergleich und Validierung des neuen TXP-AQUA workflows zum bereits am MPC bestehenden, etablierten AQUA Ansatz für die Quantifizierung von CYP3A4 und CYP3A5 in humanen Lebermikrosomen bzw. Geamtzelllysat primärer Hepatozyten; Evaluierung der Richtigkeit der Messergebnisse

- Ermittlung der Reproduzierbarkeit für die Quantifizierung von CYP3A4, CYP3A5, MDR1 und PXR in humanen Lebermikrosomen mittels TXP-AQUA durch n≥5 technische Replikate

Einzelne Punkte (1 und 2) des Arbeitsprogramms sollen bis zum geplanten Start der FoRUM-Finanzierung für die CYP3A-Subfamilie als Vorarbeiten abgeleistet werden (Details siehe 6.). Die unter 3-5 beschriebenen Arbeiten sollen während der 1-jährigen Projektlaufzeit durch die FoRUM-Förderung durchgeführt werden.

Kooperationspartner:

Dr. Roland Kellner

Leiter Protein-Labor / Pharma Proteomics

Darmstadt

Prof. Dr. Stefan Stevanovic

Interfakultäres Insitut für Zellbiologie

Tübingen

Prof. Dr. Bernhard Küster

Technische Universität München